wirus ptasiej mieloblastozy (AMV) odwrotna transkryptaza jest jednym z najczęstszych RTs stosowanych w laboratorium. Heterodimer 170kDa wymaga 6-10 mm Mg2+ lub Mn2 + do aktywności, a reakcje często obejmują pirofosforan sodu i spermidynę w celu zwiększenia produkcji cDNA o Pełnej długości i zmniejszenia tworzenia spinek do włosów podczas syntezy (3). AMV RT jest mniej wrażliwy na hamowanie przez silną strukturę wtórną RNA niż wirus białaczki Moloney (m-MLV) RT (4).,
optymalna aktywność enzymu i maksymalna długość cDNA występuje w temperaturze 42-48°C, ale temperatura reakcji może wynosić od 25°C do 58°C (5). Wyższa temperatura reakcji pomaga w denaturowaniu regionów o silnej strukturze wtórnej RNA, co może spowodować zahamowanie RTs i ograniczenie wielkości cDNA (6-7). Z tego powodu AMV RT jest często używany do odwrotnej transkrypcji RNA o silnej strukturze wtórnej. Podobnie jak inne RTs, AMV RT jest kompatybilny z primerami specyficznymi dla genów, oligo (dT)15 primers lub random hexamers, chociaż stosowanie heksamerów losowych wymaga obniżonej temperatury reakcji 37°C., Specyficzne dla genów primery RT o odpowiednio wysokich temperaturach topnienia są zalecane, gdy temperatura reakcji przekracza 42°C.
chociaż wysokie temperatury reakcji mogą skutecznie rozwiązywać regiony silnych struktur wtórnych, temperatury te są szkodliwe dla integralności RNA. RNA jest termolabilny i podatny na degradację katalizowaną metalem. Zwykle hydroliza zachodzi z niską częstotliwością, ale hydroliza RNA staje się problemem w pewnych warunkach (np. nieoptymalne pH, wysokie temperatury, obecność kationów dwuwartościowych)., Tak więc, synteza cDNA-w szczególności synteza cDNA długich RNA-korzyści z nie narażania RNA na wyższe temperatury reakcji. Aby zminimalizować ilość czasu, jaki RNA spędza w wysokich temperaturach, protokoły syntezy cDNA z wykorzystaniem AMV I m-MLV RTS często zawierają początkowy etap denaturacji, gdzie RNA i RT primer są łączone, krótko ogrzewane, aby pomóc denaturować dowolną strukturę drugorzędną, a następnie szybko schładzane na lodzie, aby utrzymać stan denaturacji. Dodaje się RT, bufor reakcji i dNTPs, a reakcja inkubowana jest w pożądanej temperaturze.,
AMV RT posiada wewnętrzną aktywność RNazy H, która rozkłada nić RNA hybrydy RNA / DNA i może rozszczepić szablon RNA, jeśli RT zatrzyma się podczas syntezy (8). Zmniejsza to całkowitą wydajność cDNA i procent cDNA pełnej długości, ograniczając przydatność AMV RT do odwrotnej transkrypcji RNA dłuższej niż ~5kb.
typowe warunki RT-PCR obejmują użycie do 5µg całkowitego RNA lub do 100ng polia+ mRNA, 20-30 jednostek enzymu i 60-minutową inkubację w temperaturze 42°C., AMV RT jest bardziej procesywny niż M-MLV RT (5-6), więc do wytworzenia tej samej ilości cDNA potrzeba mniej jednostek; 25 jednostek AMV RT odpowiada około 200 jednostkom m-MLV RT. przed zastosowaniem PCR AMV musi zostać inaktywowany, ponieważ AMV RT, podobnie jak M-MLV RT, może hamować polimerazę DNA TAQ (9). Enzym może być inaktywowany przez ogrzewanie w temperaturze 70-100°C, a następnie 5-minutową inkubację na lodzie. Reakcja odwrotnej transkrypcji jest często rozcieńczana przed PCR lub objętość cDNA dodana do PCR jest ograniczona, ponieważ spermidyna może hamować PCR (10)., Ograniczenie to może negatywnie wpływać na zdolność wykrywania RNA o niskiej obfitości.
AMV RT jest zalecany do jednoetapowego i dwuetapowego RT-PCR i RT-qPCR, odwrotnej transkrypcji RNA < 5kb i rozszerzenia primer, szczególnie jeśli szablon RNA ma silną strukturę wtórną.