Velge Riktig Revers Transkriptase

Avian myeloblastosis virus (AMV) revers transkriptase er en av de mest vanlige RTs brukes i laboratoriet. Den 170kDa heterodimer krever 6–10mM Mg2+ og Mn2+ for aktivitet, og reaksjonene er ofte inkluderer sodium pyrophosphate og spermidine å øke full-lengde cDNA produksjon og redusere dannelsen av hårnåler under syntese (3). AMV RT er mindre følsom for hemming av sterk RNA sekundær struktur enn Moloney murine leukemia virus (M-MLV) RT (4).,

Optimal enzym aktivitet og maksimalt cDNA lengde oppstå på 42-48°C, men reaksjonen kan temperaturen variere fra 25°C til 58°C (5). Den høyere reaksjon temperatur bidrar til denaturering regioner med sterk RNA sekundær struktur, noe som kan føre til RTs å stanse og begrense cDNA størrelse (6-7). For denne grunn, AMV RT er ofte brukt for å reversere transkribere RNAs med sterk sekundær struktur. Som andre RTs, AMV RT er kompatibel med gen-spesifikke primere, oligo(dT)15 primere eller tilfeldig hexamers, selv om bruken av tilfeldig hexamers krever en redusert reaksjon temperatur på 37°C., Gen-spesifikke RT primere passe høye smelte temperaturer anbefales når reaksjonen temperaturen overstiger 42°C.

Selv om høy reaksjon temperaturer kan effektivt løse regioner med sterk sekundære strukturer, disse temperaturene er skadelig for RNA integritet. RNA er thermolabile og utsatt for metall-catalyzed nedbrytning. Normalt, hydrolyse oppstår ved en lav frekvens, men RNA hydrolyse blir et problem under visse betingelser (f.eks., nonoptimal pH, høy temperatur, tilstedeværelse av divalent kationer)., Dermed cDNA-syntese—spesielt cDNA syntese av lang RNAs—fordeler fra ikke utsette RNA til høyere reaksjon temperaturer. For å minimere mengden av tid som RNA tilbringer ved høye temperaturer, cDNA syntese protokoller ved hjelp av AMV-og M-MLV RTs ofte innlemme en innledende denaturering trinn, der RNA og RT primer er kombinert, kort oppvarmet å hjelpe denaturering en sekundær struktur så raskt nedkjølt på isen for å opprettholde denaturert staten. I RT, reaksjon buffer og dntp-er er lagt til, og reaksjonen er inkubert ved ønsket temperatur.,

AMV RT har en iboende RNase H aktivitet, noe som forringer RNA strand av et RNA/DNA hybrid og kan cleave RNA mal hvis RT pauser i løpet av syntese (8). Dette reduserer de totale cDNA gi og prosentandel av full-lengde cDNA, noe som begrenser nytten av AMV RT for å reversere transkribere RNAs lenger enn ~5 kb stor.

Typiske RT-PCR-forholdene omfatter bruk av opp til 5µg av total RNA eller opp til 100ng av polyA+ mRNA, 20-30 enheter av enzymet, og en 60-minutters inkubasjon ved 42°C., AMV RT er mer processive enn M-MLV RT (5-6), slik at færre enheter er nødvendig for å generere den samme mengden av cDNA; 25 enheter av AMV RT tilsvarer ca 200 enheter av M-MLV RT. Før PCR, AMV må være inaktivert fordi AMV RT, som M-MLV RT, kan hemme Taq DNA-polymerase (9). Enzymet kan være inaktivert ved oppvarming på 70-100°C, etterfulgt av en 5-minutters inkubasjon på is. Revers transkripsjon reaksjon er ofte fortynnet før PCR eller volumet av cDNA lagt til PCR er begrenset fordi spermidine kan hemme PCR (10)., Denne begrensningen kan negativt påvirke evnen til å detektere lave overflod RNAs.

AMV RT er anbefalt for ett-trinns og to-trinns RT-PCR og RT-qPCR, revers transkripsjon av RNAs <5 kb stor og primer extension, spesielt hvis malen RNA har sterk sekundær struktur.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert. Obligatoriske felt er merket med *