Avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase is een van de meest voorkomende RTs gebruikt in het laboratorium. 170kDa heterodimer vereist 610mm Mg2 + of Mn2+ voor Activiteit, en de reacties omvatten vaak natriumpyrofosfaat en spermidine om cDNA productie van volledige lengte te verhogen en vorming van haarpins tijdens synthese (3) te verminderen. AMV RT is minder gevoelig voor remming door een sterke secundaire RNA-structuur dan het Moloney murine leukemievirus (m-MLV) RT (4).,
optimale enzymactiviteit en maximale cDNA-lengte komen voor bij 42-48°C, maar de reactietemperatuur kan variëren van 25 ° C tot 58°C (5). De hogere reactietemperatuur helpt denaturegebieden van sterke secundaire structuur van RNA, die RTS kan veroorzaken om cDNA-grootte (6-7) te stalken en te beperken. Om deze reden, wordt AMV RT vaak gebruikt om RNAs met sterke secundaire structuur om te keren. Net als andere RTs is AMV RT compatibel met genspecifieke primers, oligo (dT)15 primers of random hexamers, hoewel het gebruik van random hexamers een verminderde reactietemperatuur van 37°C vereist., Genspecifieke RT-primers met voldoende hoge smelttemperaturen worden aanbevolen wanneer de reactietemperatuur 42°C overschrijdt.
hoewel hoge reactietemperaturen regio ‘ s met sterke secundaire structuren effectief kunnen oplossen, zijn deze temperaturen schadelijk voor de integriteit van RNA. RNA is thermolabile en vatbaar voor metaal-gekatalyseerde degradatie. Normaal gesproken vindt hydrolyse plaats bij een lage frequentie, maar de hydrolyse van RNA wordt onder bepaalde omstandigheden een probleem (bijvoorbeeld niet-optimale pH, hoge temperaturen, de aanwezigheid van divalente kationen)., Aldus, profiteert cDNA synthese—in het bijzonder cDNA synthese van lange RNAs—van het niet blootstellen van RNA aan hogere reactietemperaturen. Om de hoeveelheid tijd te minimaliseren die RNA bij hoge temperaturen doorbrengt, nemen de syntheseprotocollen van cDNA die AMV en M-MLV RTs gebruiken vaak een aanvankelijke denaturatiestap op, waar de inleiding van RNA en RT worden gecombineerd, kort verwarmd om om het even welke secundaire structuur te helpen denatureren dan snel op ijs wordt gekoeld om de gedenatureerde staat te handhaven. RT, reactiebuffer en dNTPs worden toegevoegd, en de reactie wordt geïncubeerd bij de gewenste temperatuur.,
AMV RT bezit een intrinsieke RNase h-activiteit, die de RNA-streng van een RNA/DNA-hybride afbreekt en de RNA-template kan splijten als de RT tijdens de synthese pauzeert (8). Dit vermindert de totale cDNA-opbrengst en het percentage cDNA van volledige lengte, die het nut van AMV RT beperken om RN Als langer dan ~ 5kb om te keren.
typische RT-PCR-omstandigheden omvatten het gebruik van maximaal 5µg totaal RNA of maximaal 100ng polyA + mRNA, 20-30 eenheden enzym en een incubatietijd van 60 minuten bij 42°C., AMV RT is meer processief dan M-MLV RT (5-6), dus er zijn minder eenheden nodig om dezelfde hoeveelheid cDNA te genereren; 25 eenheden AMV RT is gelijk aan ongeveer 200 eenheden M-MLV RT. vóór PCR moet AMV worden geïnactiveerd omdat AMV RT, net als M-MLV RT, Taq DNA-polymerase kan remmen (9). Het enzym kan worden geïnactiveerd door te verhitten bij 70-100°C, gevolgd door een incubatie van 5 minuten op ijs. De omgekeerde transcriptiereactie wordt vaak verdund voorafgaand aan PCR of het volume van cDNA toegevoegd aan PCR is beperkt omdat spermidine PCR (10) kan remmen., Deze beperking kan de capaciteit negatief beà nvloeden om laag-overvloed RNAs te ontdekken.
AMV RT wordt aanbevolen voor een-stap en twee-stap RT-PCR en RT-qPCR, reverse transcriptie van RNAs <5kb en primer extension, met name als het template RNA een sterke secundaire structuur heeft.