Virus della mieloblastosi aviaria (AMV) la trascrittasi inversa è uno degli RTS più comuni utilizzati in laboratorio. L’eterodimero 170kDa richiede 6-10mm Mg2+ o Mn2 + per l’attività, e le reazioni spesso includono pirofosfato di sodio e spermidina per aumentare la produzione di cDNA a tutta lunghezza e diminuire la formazione di forcine durante la sintesi (3). AMV RT è meno sensibile all’inibizione da una forte struttura secondaria dell’RNA rispetto al virus della leucemia murina Moloney (M-MLV) RT (4).,
L’attività enzimatica ottimale e la lunghezza massima del cDNA si verificano a 42-48°C, ma la temperatura di reazione può variare da 25°C a 58°C (5). La temperatura di reazione più elevata aiuta a denaturare le regioni di una forte struttura secondaria dell’RNA, che può causare lo stallo degli RTS e limitare le dimensioni del cDNA (6-7). Per questo motivo, AMV RT è spesso usato per invertire trascrivere RNA con forte struttura secondaria. Come altri RTS, AMV RT è compatibile con primer gene-specifici, primer oligo(dT)15 o esameri casuali, sebbene l’uso di esameri casuali richieda una temperatura di reazione ridotta di 37°C., Primer RT gene-specifici con temperature di fusione opportunamente elevate sono raccomandati quando la temperatura di reazione supera i 42°C.
Sebbene alte temperature di reazione possano risolvere efficacemente regioni di forti strutture secondarie, queste temperature sono dannose per l’integrità dell’RNA. L’RNA è termolabile e suscettibile alla degradazione catalizzata dal metallo. Normalmente, l’idrolisi avviene a bassa frequenza, ma l’idrolisi dell’RNA diventa una preoccupazione in determinate condizioni (ad esempio, pH non ottimale, alte temperature, presenza di cationi bivalenti)., Pertanto, la sintesi di cDNA—in particolare la sintesi di cDNA di RNA lunghi-beneficia di non esporre l’RNA a temperature di reazione più elevate. Per ridurre al minimo la quantità di tempo che l’RNA trascorre ad alte temperature, i protocolli di sintesi cDNA che utilizzano AMV e M-MLV RTS spesso incorporano una fase di denaturazione iniziale, dove l’RNA e il primer RT sono combinati, brevemente riscaldati per aiutare a denaturare qualsiasi struttura secondaria, quindi rapidamente raffreddati su ghiaccio per mantenere lo stato denaturato. Vengono aggiunti RT, buffer di reazione e DNTP e la reazione viene incubata alla temperatura desiderata.,
AMV RT possiede un’attività intrinseca della RNasi H, che degrada il filamento di RNA di un ibrido RNA / DNA e può fendere il modello di RNA se l’RT si ferma durante la sintesi (8). Questo riduce la resa totale di cDNA e la percentuale di cDNA full-length, limitando l’utilità di AMV RT per invertire trascrivere RNA più lungo di ~5kb.
Le condizioni tipiche di RT-PCR includono l’uso di fino a 5µg di RNA totale o fino a 100ng di polyA+ mRNA, 20-30 unità di enzima e un’incubazione di 60 minuti a 42°C., AMV RT è più processivo di M-MLV RT (5-6), quindi sono necessarie meno unità per generare la stessa quantità di cDNA; 25 unità di AMV RT equivalgono a circa 200 unità di M-MLV RT. Prima della PCR, AMV deve essere inattivato perché AMV RT, come M-MLV RT, può inibire la Taq DNA polimerasi (9). L’enzima può essere inattivato riscaldando a 70-100°C, seguito da un’incubazione di 5 minuti su ghiaccio. La reazione di trascrizione inversa è spesso diluita prima della PCR o il volume di cDNA aggiunto alla PCR è limitato perché la spermidina può inibire la PCR (10)., Questa limitazione può influire negativamente sulla capacità di rilevare gli RNA a bassa abbondanza.
AMV RT è raccomandato per un passo e due fasi RT-PCR e RT-qPCR, trascrizione inversa di RNA < 5kb e l’estensione del primer, in particolare se il modello RNA ha una forte struttura secondaria.