Avian myeloblastosis virus (AMV) käänteiskopioijaentsyymin on yksi yleisimmistä RTs käytetään laboratoriossa. Se 170kDa heterodimer vaatii 6–10mM Mg2+ ja Mn2+ toimintaa, ja reaktiot sisältävät usein natriumpyrofosfaatti ja spermidine lisätä täyspitkä cDNA tuotantoa ja vähentää muodostumista pinnit synteesin aikana (3). AMV RT on vähemmän herkkä esto vahva RNA toissijaisia rakenteita kuin Moloney hiiren leukemia virus (M-MLV) RT (4).,
optimaalinen entsyymiaktiivisuus ja cDNA: n enimmäispituus tapahtuvat 42-48°C: ssa, mutta reaktion lämpötila voi vaihdella 25°C: sta 58°C: seen (5). Korkeampi reaktion lämpötila auttaa denaturoida alueilla vahva RNA toissijainen rakenne, joka voi aiheuttaa RTs pysähtyvän ja raja-ekspressio koko (6-7). Tästä syystä AMV RT: tä käytetään usein kääntämään RNAS: n puhtaaksikirjoitus voimakkaalla sekundaarirakenteella. Kuten muut RTs, AMV RT on yhteensopiva geeni-spesifisiä alukkeita, oligo(dT)15 alukkeita tai random hexamers, vaikka käyttö random hexamers vaatii alennetaan reaktion lämpötila on 37°C., Geeni-erityisiä RT-alukkeet, joissa on riittävän korkea sulamislämpötila on suositeltavaa, kun reaktion lämpötila on yli 42°C.
Vaikka korkea reaktion lämpötila voi tehokkaasti ratkaista alueiden vahva toisen asteen rakenteita, nämä lämpötilat ovat haitallisia RNA: n eheys. RNA on termolabiili ja altis metallikatalysoidulle hajoamiselle. Normaalisti hydrolyysi tapahtuu harvemmin, mutta RNA-hydrolyysistä tulee huolta tietyissä olosuhteissa (esim.nonoptimaalinen pH, korkeat lämpötilat, kahdenarvoisten kationien esiintyminen)., Näin, cDNA-synteesi—erityisesti cDNA synteesi kauan RNAs—hyötyä ole paljastaen RNA suurempi reaktio lämpötiloissa. Minimoida aikaa, että RNA käyttää korkeissa lämpötiloissa, cDNA-synteesi-protokollia käyttäen AMV-ja M-MLV RTs sisältävät usein on ensimmäinen denaturointivaihe, jossa RNA: n ja RT pohjamaali on yhdistetty, lyhyesti lämmitetty auttaa denaturoida tahansa toissijainen rakenne, sitten nopeasti jäähdytetään jäällä säilyttää denaturoitu valtion. RT, reaktiopuskuri ja dNTPs lisätään, ja reaktio inkuboidaan halutussa lämpötilassa.,
AMV RT on luontainen Rnaasi H-toimintaa, joka hajottaa RNA strand RNA/DNA-hybridin ja voi hajota RNA-mallia, jos RT-pauses synteesin aikana (8). Tämä vähentää yhteensä ekspressio tuotto ja osuus täyspitkä cDNA, rajoittaa hyödyllisyyttä AMV RT kääntää puhtaaksi RNAs enää kuin ~5kb.
Tyypillinen RT-PCR-olosuhteet ovat käytön jopa 5µg kokonais-RNA-tai jopa 100ng ja polyA+ mRNA, 20-30 yksikköä entsyymi ja 60 minuutin inkuboinnin 42°C., AMV RT on enemmän processive kuin M-MLV RT (5-6), joten vähemmän yksiköitä tarvitaan tuottamaan sama määrä ekspressio; 25 yksikköä AMV RT vastaa noin 200 yksikköä M-MLV RT. Ennen PCR, AMV on inaktivoitu, koska AMV RT, kuten M-MLV RT, voi estää Taq DNA polymeraasi (9). Entsyymi voidaan inaktivoida kuumentamalla 70-100°C: ssa, minkä jälkeen se inkuboidaan 5 minuuttia jäällä. Käänteinen transkriptio reaktio on usein laimennettava ennen PCR tai tilavuus ekspressio lisätään PCR on rajoitettu, koska spermidine voi estää PCR (10)., Tämä rajoitus voi vaikuttaa negatiivisesti kykyyn havaita vähäisen runsauden RNAs.
AMV RT on suositeltavaa yksi-vaihe ja kaksi-step RT-PCR ja RT-qPCR, käänteinen transkriptio RNAs <5kb ja primer-tiedostotunnistetta, erityisesti jos malli RNA on vahva toissijainen rakenne.