조류 골수 모세포증 바이러스(AMV)역전사 효소는 실험실에서 사용되는 가장 일반적인 RTs 중 하나입니다. 이 170kDa heterodimer 필요 6–10mM Mg2+또는 Mn2+를 위한 활동,반응을 포함한 나트륨 피로인산 및 spermidine 증가하 full-length cDNA 생산 및 감소는 대형의 머리는 동안 종합(3). AMV RT 는 Moloney murine leukemia virus(M-MLV)RT(4)보다 강한 RNA2 차 구조에 의한 억제에 덜 민감합니다.,
최적의 효소 활성 및 최대 cDNA 길이는 42-48°C 에서 발생하지만 반응 온도는 25°C 에서 58°C(5)범위 일 수 있습니다. 반응 온도가 높을수록 rts 가 실속하고 cDNA 크기(6-7)를 제한 할 수있는 강한 RNA2 차 구조의 변성 영역을 돕습니다. 이러한 이유로,AMV RT 는 종종 강한 2 차 구조를 갖는 rna 를 역전사하는데 사용된다. 다음과 같은 다른 RTs,AMV RT 과 호환되는 유전자의 특정 프라이머,올리고(dT)15 프라이머 또는 임의의 hexamers,비록 사용하여 임의의 hexamers 필요 감소된 반응의 온도 37°C, 유전자별 RT 프라이머와 적절하게 높은 녹는 온도가 좋을 때 반응이 온도를 초과하 42°C.
지만 높은 반응할 수 있는 온도 효과적으로 해결하는 지역의 강한 보조 구조물,이러한 온도에 해가 되고 RNA 는 무결성이 있습니다. RNA 는 열 라벨이며 금속 촉매 분해에 취약합니다. 일반적으로,가수분해에서 발생하는 저주파하지만,RNA 의 가수분해에 문제가 되는 특정 조건에서(예를 들어,최적이 아닌 pH,고온의 존재 divalent 양이온)., 따라서,cDNA 합성—특히 긴 rna 의 cDNA 합성-은 rna 를 더 높은 반응 온도에 노출시키지 않음으로부터 이익을 얻는다. 하는 시간을 최소화하는 RNA 을 보낸다 높은 온도에서,cDNA 를 합성 프로토콜을 사용하여 AMV M-MLV RTs 자주 통합 초기 단계 변성는 RNA RT 프라이머는 결합된,간단하게 가열하여 도움을 변성시킬 보조 구조한 다음 빠르게 냉각된 얼음을 유지하는 변성된 상태입니다. RT,반응 완충액 및 dNTPs 가 첨가되고,반응은 원하는 온도에서 배양된다.,
AMV RT 는 rna/DNA 하이브리드의 RNA 가닥을 분해하고 합성 중에 rt 가 일시 중지되면 RNA 템플릿을 절단 할 수있는 고유 RNase H 활성을 보유합니다(8). 이것은 총 cDNA 수율과 전장 cDNA 의 비율을 감소시켜~5kb 보다 긴 rna 를 역전사시키는 AMV RT 의 유용성을 제한합니다.
전형적인 RT-PCR 조건은 최대 5μg 의 총 RNA 또는 최대 100ng 의 polyA+mRNA,20-30 단위의 효소 및 42°C 에서의 60 분 배양의 사용을 포함한다., AMV RT 더 processive M-MLV RT(5-6),그래서 몇몇 단위를 생성하는 데 필요한 같은 양의 cDNA;의 25 단위 AMV RT 에 해당하는 약 200 단위의 M-MLV RT. 전 PCR,AMV 해 비활성화될 때문에 AMV RT,다음과 같 M-MLV RT 을 억제할 수 있 Taq DNA 중합효소 연 있습니다(9). 효소는 70-100°C 에서 가열하여 불 활성화 될 수 있으며,이어서 얼음 위에서 5 분간 배양 할 수 있습니다. 역전사 반응은 종종 PCR 이전에 희석되거나 spermidine 이 PCR(10)을 억제 할 수 있기 때문에 PCR 에 첨가 된 cDNA 의 부피가 제한된다., 이 제한은 풍부도가 낮은 Rna 를 검출하는 능력에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다.
AMV RT 이 추천한 하나 단계와 두-step RT-PCR RT-qPCR,역사의 RNAs<5 킬로와 프라이머를 확장,특히 경우 템플릿 RNA 은 강력한 보조 구조입니다.