vírus da mieloblastose aviária (AMV) transcriptase reversa é um dos RTs mais comuns utilizados no laboratório. O heterodímero de 170kDa requer 6-10mM Mg2+ ou Mn2+ para a actividade, e as reacções incluem frequentemente pirofosfato de sódio e espermidina para aumentar a produção de cDNA de comprimento completo e diminuir a formação de capilares durante a síntese (3). A IRM é menos sensível à inibição por forte estrutura secundária de ARN do que o vírus da leucemia murina Moloney (M-MLV) RT (4).,
actividade enzimática óptima e comprimento máximo de cDNA ocorrem a 42-48 ° C, mas a temperatura de reacção pode variar entre 25°C e 58°C (5). A maior temperatura de reação ajuda a desnatar as regiões de forte estrutura secundária de RNA, o que pode causar RTs para empatar e limitar o tamanho do cDNA (6-7). Por esta razão, AMV RT é muitas vezes usado para reverter a transcrição RNAs com forte estrutura secundária. Como outros RTs, AMV RT é compatível com primers específicos do gene, oligo(dT)15 primers ou hexamers aleatórios, embora o uso de hexamers aleatórios requer uma temperatura de reação reduzida de 37 ° C., Recomenda-se a utilização de iniciadores de RT específicos de genes com temperaturas de fusão adequadamente elevadas quando a temperatura de reacção excede os 42°C.
embora as altas temperaturas de reacção possam efectivamente resolver regiões de estruturas secundárias fortes, estas temperaturas são prejudiciais para a integridade do ARN. RNA é termolabile e suscetível a degradação catalisada por metais. Normalmente, a hidrólise ocorre em uma baixa frequência, mas a hidrólise de RNA torna-se uma preocupação em certas condições (por exemplo, pH não otimizado, Altas temperaturas, a presença de catiões divalentes)., Assim, a síntese de cDNA—em particular a síntese de cDNA de longas RNAs-beneficia de não expor o RNA a temperaturas de reação mais elevadas. Para minimizar a quantidade de tempo que a RNA passa a temperaturas elevadas, o cDNA a síntese de protocolos usando AMV e M-fornecedor multilíngue RTs, muitas vezes incorporam uma primeira etapa de desnaturação, onde o RNA e RT primer são combinados, brevemente aquecida para ajudar a desnaturar qualquer estrutura secundária, em seguida, rapidamente resfriado em gelo para manter o estado desnaturado. O RT, o buffer de reação e o dNTPs são adicionados, e a reação é incubada à temperatura desejada.,
AMV RT possui uma atividade RNase h intrínseca, que degrada a cadeia de RNA de um híbrido RNA/DNA e pode clivar o modelo de RNA se a RT parar durante a síntese (8). Isto reduz o rendimento total do cDNA e a percentagem do cDNA de comprimento total, limitando a utilidade do AMV RT para transcrever RNAs por mais tempo que ~5kb.as condições típicas de RT-PCR incluem a utilização de até 5 µg de ARN total ou até 100g de polyA+ mRNA, 20-30 unidades de enzima e uma incubação de 60 minutos a 42 ° C., AMV RT é mais processive de M-fornecedor multilíngue RT (5-6), portanto, menos unidades são necessárias para gerar a mesma quantidade de cDNA; 25 unidades de AMV RT é equivalente a cerca de 200 unidades do M-fornecedor multilíngue RT. Antes da PCR, AMV deve ser inativada porque AMV RT, como o M-fornecedor multilíngue RT, pode inibir a Taq DNA polimerase (9). A enzima pode ser inactivada por aquecimento a 70-100 ° c, seguida de uma incubação de 5 minutos sobre gelo. A reacção de transcrição reversa é frequentemente diluída antes da PCR ou o volume de cDNA adicionado à PCR é limitado porque a espermidina pode inibir a PCR (10)., Esta limitação pode afetar negativamente a capacidade de detectar RNAs de baixa abundância.
AMV RT é recomendado para um passo e dois passos RT-PCR e RT-qPCR, transcrição reversa de RNAs <5KB e extensão de primer, particularmente se o ARN-modelo tem uma estrutura secundária forte.