virusul mieloblastozei aviare (AMV) revers transcriptaza este una dintre cele mai frecvente RTs utilizate în laborator. La 170kDa heterodimer necesită 6–10mM Mg2+ sau Mn2+ pentru activitate, și reacții includ adesea pirofosfat de sodiu si vegetala pentru a crește full-length adnc de producție și de a reduce formarea de ace de păr în cursul sintezei (3). AMV RT este mai puțin sensibil la inhibarea de către structura secundară ARN puternic decât virusul leucemiei murine Moloney (m-MLV) RT (4).,activitatea enzimatică optimă și lungimea maximă a ADNc apar la 42-48°C, dar temperatura de reacție poate varia de la 25°C la 58°C (5). Temperatura de reacție mai mare ajută la denaturarea regiunilor cu structură secundară puternică de ARN, ceea ce poate determina RTS să se oprească și să limiteze dimensiunea ADNc (6-7). Din acest motiv, AMV RT este adesea folosit pentru a inversa transcrierea ARN-urilor cu structură secundară puternică. Ca și alte RTs, AMV RT este compatibil cu primeri specifici genei, oligo (dT)15 primeri sau hexameri aleatorii, deși utilizarea hexamerilor aleatorii necesită o temperatură de reacție redusă de 37°C., Se recomandă primeri RT specifici genelor cu temperaturi de topire ridicate în mod corespunzător atunci când temperatura de reacție depășește 42°C.
deși temperaturile ridicate de reacție pot rezolva eficient regiunile structurilor secundare puternice, aceste temperaturi sunt dăunătoare integrității ARN. ARN-ul este termolabil și susceptibil la degradarea catalizată de metal. În mod normal, hidroliza are loc la o frecvență joasă, dar hidroliza ARN devine o preocupare în anumite condiții (de exemplu, pH nonoptimal, temperaturi ridicate, prezența cationilor bivalenți)., Astfel, sinteza ADNc—în special sinteza ADNc a ARN-urilor lungi-beneficiază de faptul că nu expune ARN-ul la temperaturi de reacție mai mari. Pentru a minimiza timpul petrecut de ARN la temperaturi ridicate, protocoalele de sinteză a ADNc folosind RTs AMV și m-MLV încorporează adesea o etapă inițială de denaturare, în care ARN-ul și grundul RT sunt combinate, încălzite scurt pentru a ajuta la denaturarea oricărei structuri secundare, apoi răcite rapid pe gheață pentru a menține starea denaturată. Se adaugă RT, tampon de reacție și dNTPs, iar reacția este incubată la temperatura dorită.,
AMV RT posedă o activitate intrinsecă a Arnazei H, care degradează Catena ARN a unui hibrid ARN/ADN și poate scinda șablonul ARN dacă RT se întrerupe în timpul sintezei (8). Acest lucru reduce randamentul total al ADNc și procentul de ADNc cu lungime întreagă, limitând utilitatea AMV RT pentru a inversa transcrierea ARN-urilor mai lungi de ~5KB.condițiile tipice RT-PCR includ utilizarea a până la 5ΜG de ARN total sau până la 100ng de polyA+ ARNm, 20-30 unități de enzimă și o incubare de 60 de minute la 42°C., AMV RT este mai processive decât M-MLV RT (5-6), deci mai puține unități sunt necesare pentru a genera aceeași cantitate de adnc; 25 de unități de AMV RT este echivalentul a aproximativ 200 de unități de M-MLV RT. Înainte de a PCR, AMV trebuie să fie inactivat pentru AMV RT, ca M-MLV RT, poate inhiba Taq ADN polimerazei (9). Enzima poate fi inactivată prin încălzire la 70-100°c, urmată de o incubare de 5 minute pe gheață. Reacția de transcriere inversă este adesea diluată înainte de PCR sau volumul de ADNc adăugat la PCR este limitat, deoarece spermidina poate inhiba PCR (10)., Această limitare poate afecta negativ capacitatea de a detecta ARN-uri cu abundență scăzută.
AMV RT este recomandat pentru un singur pas și pas în doi RT-PCR și RT-pcr, transcriere inversă de RNAs <5kb și primer extension, în special în cazul în care șablonul ARN-ul are o puternică structură secundară.