virus ptačí myeloblastózy (AMV) reverzní transkriptáza je jednou z nejčastějších RTs používaných v laboratoři. Na 170kDa heterodimeru vyžaduje 6–10 mm Mg2+ nebo Mn2+ na aktivitu a reakce často obsahují pyrofosforečnan sodný a spermidinu zvýšit full-délka cDNA výroby a snížit tvorbu vlásenky během syntézy (3). AMV RT je méně citlivý na inhibici silnou sekundární strukturou RNA než Moloney murine leukémie virus (M-MLV) RT (4).,
optimální enzymová aktivita a maximální délka cDNA se vyskytují při 42-48°C, ale reakční teplota se může pohybovat od 25°C do 58°C (5). Vyšší reakční teplota pomáhá denaturovat oblasti silné sekundární struktury RNA, což může způsobit zastavení RTs a omezení velikosti cDNA (6-7). Z tohoto důvodu se AMV RT často používá k reverznímu přepisu RNA se silnou sekundární strukturou. Stejně jako jiné RTs, AMV RT je kompatibilní s genově specifickými primery, oligo(dT)15 primery nebo random hexamer, i když použití random hexamer vyžaduje snižuje reakční teplotu 37°C., Genu-specifické RT primery s vhodně vysoké teploty tání se doporučuje, pokud je reakční teplota vyšší než 42°C.
i když vysoké reakční teploty mohou efektivně vyřešit regionech silné sekundární struktury, tyto teploty jsou škodlivé pro RNA integrity. RNA je termolabilní a náchylná k degradaci katalyzované kovem. Obvykle dochází k hydrolýze při nízké frekvenci, ale hydrolýza RNA se stává problémem za určitých podmínek (např. neoptimální pH, vysoké teploty, přítomnost dvojmocných kationtů)., Syntéza cDNA-zejména syntéza cDNA dlouhých RNA-tedy těží z toho, že RNA nevykazuje vyšší reakční teploty. Aby se minimalizovalo množství času, že RNA tráví při vysokých teplotách, cDNA syntézu protokolů pomocí AMV a M-MLV RTs často začlenit počáteční denaturace krok, kde RNA a RT primer jsou kombinované, krátce zahřeje na pomoc denaturovat jakékoliv sekundární struktury pak se rychle ochladí na ledu udržovat denaturovaného stavu. Přidá se RT, reakční pufr a dNTPs a reakce se inkubuje při požadované teplotě.,
AMV RT má vlastní aktivitu Rnázy H, která degraduje řetězec RNA hybridu RNA / DNA a může štěpit šablonu RNA, pokud se RT zastaví během syntézy (8). To snižuje celkový výtěžek cDNA a procento plné délky cDNA, což omezuje užitečnost AMV RT pro reverzní přepis RNA delší než ~5KB.
typické podmínky RT-PCR zahrnují použití až 5µg celkové RNA nebo až 100ng polyA + mRNA, 20-30 jednotek enzymu a 60minutovou inkubaci při 42 ° C., AMV RT je více processive než M-MLV RT (5-6), tak méně jednotek jsou povinni vytvářet stejné množství cDNA; 25 jednotek AMV RT odpovídá přibližně 200 jednotek M-MLV RT. Před PCR, AMV musí být inaktivovány, protože AMV RT, jako M-MLV RT, může inhibovat Taq DNA polymeráza (9). Enzym může být inaktivován zahříváním při 70-100°c, následovaným 5minutovou inkubací na ledu. Reverzní transkripce reakce je často ředí před PCR nebo objem cDNA přidána do PCR je omezené, protože spermidinu může inhibovat PCR (10)., Toto omezení může negativně ovlivnit schopnost detekovat RNA s nízkým množstvím.
AMV RT se doporučuje pro jednostupňový a dvoustupňový RT-PCR a RT-qPCR, reverzní transkripci RNA <5KB a rozšíření primeru, zejména pokud má šablona RNA silnou sekundární strukturu.