valg af den rigtige revers transkriptase

aviær myeloblastosis virus (AMV) revers transkriptase er en af de mest almindelige RTs, der bruges i laboratoriet. Den 170kDa heterodimer kræver 6–10mM Mg2+ eller Mn2+ for aktivitet, og bivirkninger omfatter ofte natriumpyrophosphat og spermidine at øge full-length cDNA produktion og mindske dannelsen af hårnåle under en syntese (3). AMV RT er mindre følsom over for hæmning ved stærk RNA sekundær struktur end Moloney murine leukemia virus (m-MLV) RT (4).,

Optimal en .ymaktivitet og maksimal cDNA-længde forekommer ved 42-48.C, men reaktionstemperaturen kan variere fra 25. C Til 58. C (5). Den højere reaktionstemperatur hjælper denatureringsområder med stærk RNA-sekundær struktur, hvilket kan få RTs til at stoppe og begrænse cDNA-størrelse (6-7). Af denne grund bruges AMV RT ofte til at vende transkribere RNA ‘ er med stærk sekundær struktur. Ligesom andre RTs, AMV RT er kompatibel med gen-specifikke primere, oligo(dT)15 primere eller tilfældige hexamers, selv om brugen af tilfældige hexamers kræver en nedsat reaktion temperatur på 37°C., Gen-specifikke RT primere med passende høje smeltetemperaturer anbefales, når reaktionen temperaturen overstiger 42°C.

Selvom høj reaktion temperaturer effektivt kan løse regioner af stærke sekundære strukturer, disse temperaturer er til skade for RNA integritet. RNA er termolabil og modtagelig for metalkatalyseret nedbrydning. Normalt forekommer hydrolyse ved en lav frekvens, men RNA-hydrolyse bliver et problem under visse betingelser (F.ikke-optimal pH, høje temperaturer, tilstedeværelsen af divalente kationer)., CDNA—syntese—især cDNA-syntese af lange RNA ‘ er-drager således fordel af ikke at udsætte RNA for højere reaktionstemperaturer. For at minimere den tid, RNA bruger ved høje temperaturer, indeholder cDNA-synteseprotokoller, der bruger AMV og M-MLV RTs, ofte et indledende denatureringstrin, hvor RNA-og RT-primeren kombineres, kortvarigt opvarmes for at hjælpe med at denaturere enhver sekundær struktur, der derefter hurtigt afkøles på is for at opretholde den denaturerede tilstand. RT, reaktion buffer og dNTP ‘ er tilsættes, og reaktionen inkuberes ved den ønskede temperatur.,

AMV RT besidder en iboende RNase h-aktivitet, som nedbryder RNA-strengen af en RNA / DNA-hybrid og kan spalte RNA-skabelonen, hvis RT pauser under syntesen (8). Dette reducerer det samlede cDNA-udbytte og procentdelen af cDNA i fuld længde, hvilket begrænser nytten af AMV RT til at vende transkribere RNA ‘ er længere end ~5 KB.

typiske RT-PCR-betingelser inkluderer anvendelse af op til 5µg total RNA eller op til 100ng polyA+ mRNA, 20-30 enheder en ,ym og en 60-minutters inkubation ved 42 C. C., AMV RT er mere processive end M-MLV RT (5-6), så færre enheder er nødvendig for at producere den samme mængde af cDNA; 25 enheder af AMV RT svarer til cirka 200 enheder af M-MLV RT. Inden PCR, AMV skal inaktiveres, fordi AMV RT, som M-MLV RT, kan hæmme Taq-DNA-polymerase (9). En .ymet kan inaktiveres ved opvarmning ved 70-100.C efterfulgt af en 5 minutters inkubation på is. Den omvendte transkriptionsreaktion fortyndes ofte før PCR, eller mængden af cDNA tilsat til PCR er begrænset, fordi spermidin kan hæmme PCR (10)., Denne begrænsning kan påvirke evnen til at opdage lav overflod RNA ‘ er negativt.

AMV RT anbefales til et-trins og to-trins RT-PCR RT-qPCR, revers transskription af Rna <5kb og primer extension, især hvis skabelonen RNA har stærke sekundære struktur.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret. Krævede felter er markeret med *