madár myeloblastosis vírus (AMV) a reverz transzkriptáz az egyik leggyakoribb RTs, amelyet a laborban használnak. A 170kda heterodimer aktivitásához 6–10mM Mg2+ vagy Mn2+ szükséges, és a reakciók gyakran tartalmaznak nátrium-pirofoszfátot és spermidint, hogy növeljék a teljes hosszúságú cDNS termelést és csökkentsék a hajszálak képződését a szintézis során (3). Az AMV RT kevésbé érzékeny az erős RNS-szekunder szerkezet gátlására, mint a Moloney murine leukémia vírus (M-MLV) RT (4).,
optimális enzimaktivitás és maximális cDNS hossz 42-48°C-on fordul elő, de a reakció hőmérséklete 25°C-tól 58°C-ig terjedhet (5). A magasabb reakcióhőmérséklet segíti az erős RNS szekunder szerkezet denaturáló régióit, ami miatt az RTs leállhat, és korlátozhatja a cDNA méretét (6-7). Emiatt az AMV RT-t gyakran használják az erős másodlagos szerkezetű RNS-ek átírására. A többi RTs-hez hasonlóan az AMV RT kompatibilis a génspecifikus primerekkel, az oligo (dT) 15 primerekkel vagy véletlenszerű hexamerekkel, bár a véletlenszerű hexamerek használata 37°C-os csökkentett reakcióhőmérsékletet igényel., Génspecifikus RT alapozók megfelelő magas olvadáspontú ajánlott, ha a reakció hőmérséklete meghaladja a 42°C-on
bár a magas reakcióhőmérséklet képes hatékonyan megoldani régiók erős másodlagos struktúrák, ezek a hőmérsékletek károsak RNS integritását. Az RNS termolabil és érzékeny a fémkatalizált lebomlásra. Normális esetben a hidrolízis alacsony frekvencián történik, de az RNS-hidrolízis bizonyos körülmények között aggodalomra ad okot (például nem optimális pH, magas hőmérséklet, kétértékű kationok jelenléte)., Így a cDNA szintézis—különösen a hosszú RNS-k cDNA-szintézise-előnye, hogy nem teszi ki az RNS-t magasabb reakcióhőmérsékletnek. Minimalizálni azt az időt, hogy RNS tölti magas hőmérsékleten, cdns szintézis protokollok felhasználásával, valamint az AMV-M-MLV RTs gyakran bele egy kezdeti denaturáció lépés, ahol az RNS, valamint RT primer kombinált, rövid ideig fűtött segíteni denature bármilyen másodlagos szerkezete, akkor gyorsan hűtött jégen, hogy fenntartsák a denaturált állapotban. Az RT-t, a reakciópuffert és a dNTPs-t hozzáadjuk, és a reakciót a kívánt hőmérsékleten inkubáljuk.,
az AMV RT intrinsic RNase H aktivitással rendelkezik, amely lebontja egy RNS/DNS hibrid RNS-szálát, és lebonthatja az RNS sablont, ha az RT szünetel a szintézis során (8). Ez csökkenti a teljes cDNA hozamot és a teljes hosszúságú cDNA százalékos arányát, korlátozva az AMV RT hasznosságát a ~5KB-nél hosszabb RNS átírására.
a tipikus RT-PCR állapotok közé tartozik a legfeljebb 5 µg teljes RNS vagy legfeljebb 100ng polyA+ mRNS, 20-30 egység enzim és 60 perces inkubáció 42°C-on., Az AMV RT több processive, mint M-MLV RT (5-6), így kevesebb egységek kötelesek létrehozni ugyanazt a mennyiségű cdns; 25 egység AMV RT egyenértékű körülbelül 200 egység M-MLV RT. Előtt PCR, AMV kell inaktivált, mert az AMV RT, mint az M-MLV RT, gátolja a Taq DNS polimeráz (9). Az enzim inaktiválható 70-100°C-os melegítéssel, majd 5 perces inkubációval jégen. A reverz transzkripciós reakciót gyakran a PCR előtt hígítják, vagy a PCR-hez hozzáadott cDNS mennyisége korlátozott, mivel a spermidin gátolhatja a PCR-t (10)., Ez a korlátozás negatívan befolyásolhatja az alacsony bőség RNS észlelésének képességét.
az AMV RT ajánlott egylépcsős és kétlépcsős RT-PCR és RT-qPCR esetén, RNS reverz transzkripciója <5KB és primer kiterjesztés esetén, különösen akkor, ha a sablon RNS erős másodlagos szerkezetű.