Aviäres Myeloblastose-Virus (AMV) Die umgekehrte Transkriptase ist eine der häufigsten im Labor verwendeten RTs. Das 170kDa-Heterodimer benötigt 6-10mM Mg2+ oder Mn2+ für die Aktivität, und Reaktionen umfassen häufig Natriumpyrophosphat und Spermidin, um die cDNA-Produktion in voller Länge zu erhöhen und die Bildung von Haarnadeln während der Synthese zu verringern (3). AMV RT ist weniger empfindlich gegenüber Hemmung durch starke RNA-Sekundärstruktur als Moloney murine Leukämie Virus (M-MLV) RT (4).,
Optimale Enzymaktivität und maximale cDNA-Länge treten bei 42-48°C auf, die Reaktionstemperatur kann jedoch zwischen 25°C und 58°C liegen (5). Die höhere Reaktionstemperatur hilft, Regionen mit starker RNA-Sekundärstruktur zu denaturieren, was dazu führen kann, dass RTs zum Stillstand kommt und die cDNA-Größe begrenzt (6-7). Aus diesem Grund wird AMV RT häufig verwendet, um RNAs mit starker Sekundärstruktur umzukehren. Wie andere RTs ist AMV RT mit genspezifischen Primern, Oligo(dT)15-Primern oder zufälligen Hexamern kompatibel, obwohl die Verwendung von zufälligen Hexamern eine reduzierte Reaktionstemperatur von 37°C erfordert., Genspezifische RT-Primer mit entsprechend hohen Schmelztemperaturen werden empfohlen, wenn die Reaktionstemperatur 42°C überschreitet
Obwohl hohe Reaktionstemperaturen Regionen starker Sekundärstrukturen effektiv auflösen können, sind diese Temperaturen schädlich für die RNA-Integrität. RNA ist thermolabil und anfällig für metallkatalysierten Abbau. Normalerweise erfolgt die Hydrolyse mit niedriger Frequenz, aber die RNA-Hydrolyse wird unter bestimmten Bedingungen (z. B. nicht optimaler pH-Wert, hohe Temperaturen, Vorhandensein zweiwertiger Kationen) zu einem Problem., Somit profitiert die cDNA—Synthese—insbesondere die cDNA-Synthese langer RNAs-davon, dass die RNA keinen höheren Reaktionstemperaturen ausgesetzt wird. Um die Zeit zu minimieren, die RNA bei hohen Temperaturen verbringt, enthalten cDNA-Syntheseprotokolle unter Verwendung von AMV-und M-MLV-RTs häufig einen anfänglichen Denaturierungsschritt, bei dem die RNA und der RT-Primer kombiniert und kurz erhitzt werden, um eine sekundäre Struktur zu denaturieren, die dann schnell auf Eis gekühlt wird, um den denaturierten Zustand aufrechtzuerhalten. Der RT, Reaktionspuffer und dNTPs werden zugegeben, und die Reaktion wird bei der gewünschten Temperatur inkubiert.,
AMV RT besitzt eine intrinsische RNase-H-Aktivität, die den RNA-Strang eines RNA/DNA-Hybriden abbaut und die RNA-Schablone spalten kann, wenn der RT während der Synthese pausiert (8). Dies reduziert die Gesamt-cDNA-Ausbeute und den Prozentsatz der cDNA in voller Länge, wodurch die Nützlichkeit von AMV RT zur umgekehrten Transkription von RNAs, die länger als ~5 KB sind, begrenzt wird.
Typische RT-PCR-Bedingungen umfassen die Verwendung von bis zu 5µg Gesamt-RNA oder bis zu 100ng polyA + mRNA, 20-30 Einheiten Enzym und eine 60-minütige Inkubation bei 42°C., AMV RT ist prozessiver als M-MLV RT (5-6), so dass weniger Einheiten erforderlich sind, um die gleiche Menge an cDNA zu erzeugen; 25 Einheiten AMV RT entspricht etwa 200 Einheiten M-MLV RT. Vor der PCR muss AMV inaktiviert werden, da AMV RT, wie M-MLV RT, Taq-DNA-Polymerase hemmen kann (9). Das Enzym kann durch Erhitzen auf 70-100°C, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation auf Eis, inaktiviert werden. Die umgekehrte Transkriptionsreaktion wird häufig vor der PCR verdünnt oder das der PCR zugesetzte cDNA-Volumen ist begrenzt, da Spermidin die PCR hemmen kann (10)., Diese Einschränkung kann sich negativ auf die Fähigkeit auswirken, RNAs mit geringer Häufigkeit zu erkennen.
AMV RT wird für die einstufige und zweistufige RT-PCR und RT-qPCR, die umgekehrte Transkription von RNAs empfohlen <5kb und Primererweiterung, insbesondere wenn die Template-RNA eine starke Sekundärstruktur aufweist.