Avian myeloblastosis virus (AMV) omvänd transkriptas är en av de vanligaste RTs som används i labbet. Den 170kDa heterodimer kräver 6-10mM Mg2 + eller Mn2 + för aktivitet, och reaktioner inkluderar ofta natriumpyrofosfat och spermidin att öka fullängds cDNA produktion och minska bildandet av hårnålar under syntes (3). AMV RT är mindre känslig för hämning av stark rna sekundär struktur än Moloney Murin leukemi virus (m-MLV) RT (4).,
Optimal enzymaktivitet och maximal cDNA-längd uppträder vid 42-48 ° C, men reaktionstemperaturen kan variera från 25 ° C till 58 ° C (5). Den högre reaktionstemperaturen hjälper denature regioner av stark rna sekundär struktur, vilket kan orsaka RTs att Stalla och begränsa cDNA storlek (6-7). Av denna anledning används AMV RT ofta för att vända transkribera rna med stark sekundär struktur. Liksom andra RTs är AMV RT kompatibel med genspecifika primers, oligo (dT)15 primers eller slumpmässiga hexamers, även om användning av slumpmässiga hexamers kräver en reducerad reaktionstemperatur på 37 ° C., Genspecifika RT-primrar med lämpligt höga smälttemperaturer rekommenderas när reaktionstemperaturen överstiger 42 ° C.
även om höga reaktionstemperaturer effektivt kan lösa regioner med starka sekundära strukturer, är dessa temperaturer skadliga för RNA-integriteten. RNA är termolabil och mottaglig för metallkatalyserad nedbrytning. Normalt sker hydrolys vid låg frekvens, men rna-hydrolys blir ett problem under vissa förhållanden (t.ex. icke-optimalt pH, höga temperaturer, närvaron av divalenta katjoner)., Således, cDNA syntes—i synnerhet cDNA syntes av långa rna—fördelar från att inte utsätta RNA för högre reaktionstemperaturer. För att minimera den tid som RNA spenderar vid höga temperaturer, innehåller cDNA-syntesprotokoll med AMV och M-MLV RTS ofta ett initialt denatureringssteg, där RNA-och RT-primern kombineras, upphettas kort för att hjälpa denaturera någon sekundär struktur och kyls sedan snabbt på is för att bibehålla det denaturerade tillståndet. RT, reaktionsbuffert och dNTPs tillsätts, och reaktionen inkuberas vid önskad temperatur.,
AMV RT besitter en inneboende rna h-aktivitet, som försämrar RNA-strängen av en RNA / DNA-hybrid och kan klyva rna-mallen om RT pausar under syntesen (8). Detta minskar den totala cDNA avkastning och andelen Full längd cDNA, vilket begränsar nyttan av AMV RT att vända transkribera RNAs längre än ~5KB.
typiska RT-PCR-tillstånd innefattar användning av upp till 5 µg totalt RNA eller upp till 100 ng polyA + mRNA, 20-30 enheter enzym och en 60 minuters inkubation vid 42 ° C., AMV RT är mer processiv än M-MLV RT (5-6), så färre enheter krävs för att generera samma mängd cDNA; 25 enheter AMV RT motsvarar cirka 200 enheter M-MLV RT. före PCR måste AMV inaktiveras eftersom AMV RT, som m-MLV RT, kan hämma Taq DNA-polymeras (9). Enzymet kan inaktiveras genom uppvärmning vid 70-100°C, följt av en 5-minuters inkubation på is. Den omvända transkriptionsreaktionen späds ofta före PCR eller volymen av cDNA tillsatt till PCR är begränsad eftersom spermidin kan hämma PCR (10)., Denna begränsning kan negativt påverka förmågan att upptäcka låg överflöd rna.
AMV RT rekommenderas för ett steg och två steg RT-PCR och RT-qPCR, omvänd transkription av RNAs < 5KB och primer förlängning, särskilt om mallen RNA har stark sekundär struktur.